Enzima de restrição

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Estrutura de solução da enzima de restrição EcoRI conforme publicado no Protein Data Bank.

As enzimas de restrição ou endonucleases de restrição são enzimas especiais que cortam (clivam) a fita dupla de ADN através do reconhecimento de seqüências curtas de nucleotídeos específicas denominadas sítios de restrição da enzima.[1] As sequências de reconhecimento geralmente variam entre 4 a 8 nucleotídeos, e muitos deles são palindrômicos. As formas palindrômicas podem ser em espelhamento (mirror-like) ou repetidas de forma invertida (inverted repeat).

Tipos

As enzimas de restrição são geralmente classificadas em três tipos: I, II e III.

  • Tipo I: Clivam em locais remotos do sítio de reconhecimento;
  • Tipo II: Clivam em locais no próprio sítio de reconhecimento ou em curtas distâncias específicas do sítio de reconhecimento.
  • Tipo III:Clivam em locais a uma curta distância do sítio de reconhecimento;

Forma de Uso

As enzimas de restrição são enzimas bacterianas que atuam identificando seqüências de pares de bases específicas em moléculas de ADN e clivando-as nesses pontos. Diferentes espécies de bactérias produzem diferentes nucleases de restrição, de forma a protegê-las contra os vírus pela degradação do ADN viral que venha a entrar na bactéria.[2] Elas tem alta especificidade: cada enzima reconhece e cliva apenas uma determinada seqüência de nucleotídeos, em geral constituída de 4 a 8 pares de bases nitrogenadas. Uma enzima de restrição irá clivar o ADN em um conjunto de fragmentos, denominados fragmentos de restrição, que são determinados pelos locais onde se encontram os sítios de restrição.[3]

Aplicações

As endonucleases de restrição são utilizadas para digerir o o ADN genômico de forma a ser realizada uma análise de genes por por Southern blot. Outra aplicação de enzimas de restrição é a sua utilização na localização de mutações em mapas de restrição. Uma mutação, em certos sítios de clivagem vai resultar numa alteração do tamanho dos fragmentos produzidos por uma enzima específica possibilitando a identificação de mutações no mapa.[4]

Outra utilização de enzimas de restrição é a de serem empregues para sondar o estado de metilação do ADN. Cerca de 98% dos dinucleotídeos CpG são metilados com exceções que tipicamente marcam as extremidades 5' de genes.[5] Ambas as endonucleases de restrição HpaII e MspI reconhecer e clivam em sítios CCGG (ver tabela abaixo). Contudo, MspI clivará tanto sítios metilados (CMeCGG) quanto não metilados ao passo que HpaII só clivará sítios não metilados.[5] Comparando a ação das duas enzimas, em uma amostra faz com que seja possível distinguir os sítios de restrição de interesse.

Bancos de dados de enzimas de restrição

EMBOSS é um pacote de análise, software livre de fonte aberta, especialmente desenvolvido para uso em biologia molecular e bioinformática.[6] Uma das ferramentas do EMBOSS é a redata que busca no banco de dados REBASE para obter informações sobre uma enzima de restrição especificada.[7]


Exemplos de enzimas de restrição

Enzima Fonte Sequência reconhecida Pontos de clivagem Clivagem Tipo de ponta
AluI[1] Arthrobacter luteus
5'AGCT 
3'TCGA 
5'AGCT 
3'TCGA 
5'---AG  CT---3'
3'---TC  GA---5'
Reta (blunt end)
BamHI[1] Bacillus amyloliquefaciens
5'GGATCC
3'CCTAGG
5'GGATCC
3'CCTAGG
5'---G     GATCC---3'
3'---CCTAG     G---5'
Adesiva (sticky end)
EcoRI[1] Escherichia coli
5'GAATTC
3'CTTAAG
5'GAATTC
3'CTTAAG
5'---G     AATTC---3'
3'---CTTAA     G---5'
Adesiva (sticky end)
EcoRII Escherichia coli
5'CCWGG
3'GGWCC
5'CCWGG
3'GGWCC
5'---     CCWGG---3'
3'---GGWCC     ---5'
Adesiva (sticky end)
EcoRV Escherichia coli
5'GATATC
3'CTATAG
5'GATATC
3'CTATAG
5'---GAT  ATC---3'
3'---CTA  TAG---5'
Reto (blunt end)
EcoP15I Escherichia coli
5'CAGCAGN25NN
3'GTCGTCN25NN
5'CAGCAGN25NN
3'GTCGTCN25NN
5'---CAGCAGN25   NN---3'
3'---GTCGTCN25NN   ---5'
Combinando parcialmente(Frayed end)
HaeIII[1] Haemophilus aegyptius
5'GGCC
3'CCGG
5'GGCC
3'CCGG
5'---GG  CC---3'
3'---CC  GG---5'
Reta (blunt end)
HhaI[1] Haemophilus haemolyticus
5'GCGC
3'CGCG
5'GCGC
3'CGCG
5'---GCG  C---3'
3'---C  GCG---5'
Adesiva (sticky end)
HindII[8] Haemophilus influenzae
5'GTGGAC
3'CAGCTG
5'GTGGAC
3'CAGCTG
5'---GTG   GAC---3'
3'---CAG   CTG---5'
Adesiva (sticky end)
HindIII Haemophilus influenzae
5'AAGCTT
3'TTCGAA
5'AAGCTT
3'TTCGAA
5'---A     AGCTT---3'
3'---TTCGA     A---5'
Adesiva (sticky end)
HinfI Haemophilus influenzae
5'GANTC
3'CTNAG
5'GANTC
3'CTNAG
5'---G   ANTC---3'
3'---CTNA   G---5'
Combinando parcialmente(Frayed end)
HpaI[2] Haemophilus parainfluenzae
5'GTTAAC
3'CAATTG
5'GTTAAC
3'CAATTG
5'---GTT  AAC---3'
3'---CAA  TTG---5'
Reta (blunt end)
HpaII Haemophilus parainfluenzae
5'CCGG
3'GGCC
5'CCGG
3'GGCC
5'---C    CGG---3'
3'---GGC   CG---5'
Adesiva (sticky end)
KpnI[9] Klebsiella pneumoniae
5'GGTACC
3'CCATGG
5'GGTACC
3'CCATGG
5'---GGTAC  C---3'
3'---C  CATGG---5'
Adesiva (sticky end)
MspI Moraxella
5'CCGG
3'GGCC
5'CCGG
3'GGCC
5'---C    CGG---3'
3'---GGC   CG---5'
Adesiva (sticky end)
NotI Nocardia otitidis
5'GCGGCCGC
3'CGCCGGCG
5'GCGGCCGC
3'CGCCGGCG
5'---GC   GGCCGC---3'
3'---CGCCGG   CG---5'
Adesiva (sticky end)
PvuII Proteus vulgaris
5'CAGCTG
3'GTCGAC
5'CAGCTG
3'GTCGAC
5'---CAG  CTG---3'
3'---GTC  GAC---5'
Reta (blunt end)
PstI[2] Providencia stuartii
5'CTGCAG
3'GACGTC
5'CTGCAG
3'GACGTC
5'---CTGCA  G---3'
3'---G  ACGTC---5'
Adesiva (sticky end)
SmaI Serratia marcescens
5'CCCGGG
3'GGGCCC
5'CCCGGG
3'GGGCCC
5'---CCC  GGG---3'
3'---GGG  CCC---5'
Reta (blunt end)
SpeI Sphaerotilus natans
5'ACTAGT
3'TGATCA
5'ACTAGT
3'TGATCA
5'---A  CTAGT---3'
3'---TGATC  A---5'
Adesiva (sticky end)
Sau3A Staphylococcus aureus
5'GATC
3'CTAG
5'GATC
3'CTAG
5'---     GATC---3'
3'---CTAG     ---5'
Adesiva (sticky end)
SacI[9] Streptomyces achromogenes
5'GAGCTC
3'CTCGAG
5'GAGCTC
3'CTCGAG
5'---GAGCT  C---3'
3'---C  TCGAG---5'
Adesiva (sticky end)
SalI[9] Streptomyces albus
5'GTCGAC
3'CAGCTG
5'GTCGAC
3'CAGCTG
5'---G  TCGAC---3'
3'---CAGCT  G---5'
Adesiva (sticky end)
SphI[9] Streptomyces phaeochromogenes
5'GCATGC
3'CGTACG
5'GCATGC
3'CGTACG
5'---GCATG  C---3'
3'---C  GTACG---5'
Adesiva (sticky end)
StuI[10] Streptomyces tubercidicus
5'AGGCCT
3'TCCGGA
5'AGGCCT
3'TCCGGA
5'---AGG  CCT---3'
3'---TCC  GGA---5'
Reta (blunt end)
ScaI[9] Streptomyces caespitosus
5'AGTACT
3'TCATGA
5'AGTACT
3'TCATGA
5'---AGT  ACT---3'
3'---TCA  TGA---5'
Reta (blunt end)
TaqI Thermus aquaticus
5'TCGA
3'AGCT
5'TCGA
3'AGCT
5'---T   CGA---3'
3'---AGC   T---5'
Adesiva (sticky end)
XbaI[9] Xanthomonas badrii
5'TCTAGA
3'AGATCT
5'TCTAGA
3'AGATCT
5'---T  CTAGA---3'
3'---AGATC  T---5'
Adesiva (sticky end)
XhoI[1] Xanthomonas campestris
5'CTCGAG
3'GAGCTC
5'CTCGAG
3'GAGCTC
5'---C  TCGAG---3'
3'---GAGCT  C---5'
Adesiva (sticky end)

Referências

  1. 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 Hartl, Daniel L. Princípios de Genética de População. 3ª ed. São Paulo: Funpec Editora, 2008. p. 7. ISBN 978-85-7747-022-8
  2. 2,0 2,1 2,2 Alberts, Bruce; Johnson, Alexander; Lewis, Julian; Raff, Martin; Roberts, Keith; Walters, Peter. Molecular Biology of the Cell. 5ª ed. New York and London: Garland Science, 2008. p. 532-535. ISBN 0-8153-4105-9
  3. Griffiths, Anthony J. F.; Wessler, Susan R.; Lewontin, Richard C.; Carroll, Sean B. Introdução à Genética. 9ª ed. Rio de Janeiro, RJ: Guanabara Koogan, 2009. p. 611. ISBN 978-85-277-1497-6
  4. Lesk, Arthur M. Introduction to Bioinformatics. 3ª ed. Oxford: Oxford University Press, 2008. p. 75. ISBN 978-0-19-920804-3
  5. 5,0 5,1 Alphey, Luke. DNA Sequencing:From Experimental Methods to Bioinformatics. New York: Springer/Bios Scientific Publishers, 1997. p. 92. ISBN 0-387-91509-5
  6. Rice P, Longden I, Bleasby A. (2000). "EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite". Trends in Genetics 16 (6): 276–277. PMID 10827456.
  7. Markell, Scott; León, Darryl. Sequence Analysis in a Nutshell. Sebastopol, CA: O'Reilly, 2003. p. 186. ISBN 0-596-00494-X
  8. Panno, Joseph. The Cell: Evolution of the First Organism. New York: Facts on File, Inc., 2005. p. 134-135. ISBN 0-8160-4946-7
  9. 9,0 9,1 9,2 9,3 9,4 9,5 Krieger, M.; Scott, M. P.; Matsudaira, P. T.; Lodish, H. F.; Darnell, J. E.; Zipursky, L; Kaiser, C.; Berk, A. Molecular Cell Biology. [S.l.: s.n.]. ISBN 0-7167-4366-3
  10. Shimotsu, H.; Takahashi, H.; Saito, H. (1980). "A new site-specific endonuclease StuI from Streptomyces tubercidicus". Gene 11 (3–4): 219–25. DOI:10.1016/0378-1119(80)90062-1. PMID 6260571.

Ligações externas